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Service de capture de séquence

 

Dans les dernières trois années, le CRB GADIE a développé des méthodes liées au séquençage de nouvelle génération (NGS). En particulier, avec le projet ANR 'CapSeqAn', la plateforme s'est positionnée sur les techniques de reséquençage de régions ciblées. Ces approches sont connues avec le nom de capture de séquence ou targeted resequencing.

En effet, à présent le coût du reséquençage d'un génome complet de mammifère (taille comprise entre 2,5 et 3,0 Gb) en utilisant la technologie Illumina (séquenceurs HiSeq 1000 ou HiSeq 2000) est relativement réduit ; cependant, si l'on veut travailler sur un nombre élevé d'individus, ce coût reste encore élevé. De plus, dans beaucoup de cas, il n'est pas nécessaire de reséquencer le génome entier, mais il suffit de se concentrer sur une ou plusieurs régions spécifiques.

Les protocoles classiques de reséquençage NGS permettent de préparer facilement des librairies pour obtenir la séquence du génome complet, mais par contre cibler des régions spécifiques est plus compliqué et nécessite le développement de technologies appropriées. La capture de séquence répond à ces exigences particulières.

 

Les services proposés

Dans le cadre de 'CapSeqAn', le CRB GADIE a d'abord optimisé une méthode de capture en phase solide (NimbleGen). Au niveau pratique, ce protocolee utilise un type de puce à ADN semblable aux tiling arrays. Cette technologie permet une réduction des coûts très importante ; un des aspects qui permettent cette réduction est le fait de pouvoir travailler en multiplexage, c’est-à-dire en parallèle sur plusieurs individus. A présent, la plateforme évolue vers les méthodes de capture en phase liquide, qui permettent une simplification des flux de travail.

Au niveau des services proposés, la plateforme d'abord prend en charge le design des arrays de capture ; cette étape est menée en collaboration avec l'utilisateur et NimbleGen, ce qui permet d'obtenir un array de capture personnalisé pour chaque projet et pour chaque type de problématique.

En suite, le CRB GADIE prépare les librairies de séquençage, ce qui inclut plusieurs étapes de controle de qualité standardisées. La librairie en post-capture, une fois validée, est envoyée à des plateformes externes pour les étapes de séquençage. En suite, le CRB GADIE récupère les données produites et prend en charge les analyses.

 

Les données livrées

A la fin de l'étape d'analyse des données, les utilisateurs reçoivent une série standardisée de fichiers, et en particulier :

  • les données brutes en format .fastq
  • les fichiers .bam, qui contiennent les informations relatives à l'alignement des séquences
  • les fichiers .vcf, qui contiennent les informations relatives au SNP calling et à l'INDEL calling

 

Les dernières évolutions de l'activité

Dans les derniers mois, une nouvelle application de la capture de séquence a été mise en place. Il s’agit de capturer non pas des régions ciblées dans un génome d’intérêt, mais des génomes entiers de pathogènes qui ne peuvent pas être cultivés en vitro.

L’ADN total est extrait à partir d’un échantillon biologique infecté par le pathogène (par exemple du sang), et en suite une librairie par capture de séquence est préparée en ciblant le génome du pathogène. Il est clair que, pour pouvoir utiliser ce type d’approche, il faut disposer de la séquence d’une souche déjà séquencée du même pathogène, ou d’un pathogène proche du point de vue taxonomique.

Cette approche a été décrite au départ par Melnikov et al. (2011), qui l’a utilisée pour le séquençage de certaines souches de Plasmodium falciparum à partir du sang humain infecté. Le CRB GADIE a adapté le protocole et l’a d'abord appliqué au séquençage de la souche bovine d’Anaplasma phagocytophilum. Cette application a été développée dans le cadre d’une collaboration avec l’UMR BIPAR (ENVA-ANSES-UPEC)-USC INRA (Alfort).

 

Rédacteur: Marco Moroldo - Dernière modification: 21 June 2013