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L'atelier microarrays

 

 

L’étude du transcriptome est une approche commune pour décrire et étudier de l’impact de différents facteurs sur les systèmes biologiques. En mesurant l’abondance de milliers de transcrits simultanément, il est possible de révéler des régulations de gènes spécifiques ou de mettre en évidence des modulations coordonnées d’ensembles de gènes impliqués dans une même voie biologique.

La technologie des microarrays ('puces à ADN') est une approche classique, solide et fiable pour l'étude du transcriptome. Le CRB GADIE utilise la technologie de l'entreprise Agilent, qui est une des plus répandues dans ce domaine, et qui fournit un catalogue de produits particulièrement intéressant et complet pour la communauté de la génomique animale. A présent, les étapes de laboratoire et les analyses des donnés se basent sur des protocoles standardisés et bien maîtrisés, qui permettent d'obtenir les résultats de manière très rapide.

 

Les services proposés

Le CRB GADIE offre un service complet d'analyse de transcriptome basé sur les microarrays de la société commerciale Agilent. Les utilisateurs peuvent demander un service complet, c'est-à-dire à partir de la rétrotranscription des échantillons d'ARN jusqu'à la production des données brutes, ou alors des services à façon, comme par exemple la seule lecture ('scan') des lames. Dans ce cadre, la plateforme dispose de tous les équipements nécessaires pour analyser les échantillons selon la technologie proposée par Agilent, incluant le scanner à haute résolution 'G2565CA'.

La plateforme accompagne les utilisateurs dans la conception et dans la préparation du projet, en particulier pour ce qui concerne le design de l'expérience (ex. définition du nombre de réplicats biologiques) et d'autres aspects techniques relatifs à la préparation des échantillons. En suite, les étapes de laboratoire sont menées par le personnel spécialisé de la plateforme, et des contrôles de qualité standardisés sont prévus.

En effet, l'étape de définition du design expérimental en transcriptomique et suovent sous estimée, alors que pour obtenir des résultats fiables il est indispensable de bien définir certains aspects dès le départ. D'un point de vue général, on peut dire que le choix du nombre de réplicats biologiques dépend de ces facteurs :

  • le niveau de variabilité de la population étudiée
  • le niveau de variation d'expression que l'on veut détecter
  • le pouvoir statistique choisi pour la détection de l'expression

Tous ces aspects doivent être définis de manière précise dès le départ. Les utilisateurs sont conseillés de se renseigner auprès de la plateforme pour avoir plus de détails ; à ce sujet, il est également très util de lire cet article de Wei et collaborateurs (2004).

 

Un des avantages de la technologie Agilent est le fait de disposer d'un catalogue très complet de produits pour la génomique animale et au même temps la possibilité de produire des design à façon ('custom') de manière très simple. D'un côté, ils existent des puces commerciales pour nombreuses espèces d'intérêt économique comme le bovin, le cheval, le lapin, le porc, le chien, le poulet et le saumon, ainsi que pour des espèces model comme la souris ou le rat.

De l'autre côté, des design à façon peuvent être facilement réalisés par les utilisateurs qui le souhaitent en utilisant le logiciel Earray. Il est possible de créer des design pour des espèces qui n'apparaissent pas dans le catalogue en ligne, mais il est également possible de modifier des design standard en ajoutant un certain nombre de sondes personnalisées. Pour avoir plus d'information concernant les design à façon, les utilisateurs sont invités à se mettre en contact directement avec la plateforme.

Agilent propose des arrays de différents formats et avec différentes caractéristiques. En général, le format utilisé le plus fréquemment au CRB GADIE est le 8x60K : dans ce cas, huit échantillons différents sont hybridés en parallèle sur la même lame, et un maximum de 60 000 sondes est disponible pour l'étude du transcriptome. Ce type de format présente aussi d'autres avantages, notamment parce que les quantités d'ARN nécessaires au départ sont relativement faibles.

 

Les données livrées

A la fin de la réalisation de l'expérience de laboratoire, les utilisateurs reçoivent une série standardisée de fichiers, et en particulier :

  • les fiches de laboratoire qui incluent les contrôles de qualité menés pendant les étapes de laboratoire et les plans de dépôt des échantillons sur les arrays
  • les images brutes (.tiff) obtenues à travers le scanner
  • les fichiers .txt obtenus à partir de l'analyse des images brutes à l'aide du logiciel Feature Extraction. Ces fichiers représentent le point de départ pour les analyses en aval
  • les fichiers .pdf correspondant aux contrôles de qualité standard Agilent. Ces fichiers sont produits en analisant les images brutes selon une procédure standardisée

 

 

 

 

L'évolution de l'activité

A partir de l'année 2011, le CRB GADIE a conduit en total environ 2 400 hybridations. En particulier, en 2014 environ 750 échantillons ont déjà été traités. L'activité est encore en augmentation, et la plateforme collabore désormais non seulement avec plusieurs départements de l'INRA (en particulier GA, SA, PHASE, Micalis et AlimH), mais également avec d'autres institutions académiques et hospitalières (par exemple, avec l'Hôpital Saint Antoine et avec l'Inserm).

En 2014, la plateforme a continué à diversifier les services offerts par l'atelier microarrays. La pipeline d'analyse de la qualité des données a été mise à jour, en ajoutant d'autres fonctionnalités qui mieux permettent d'explorer les données. Il s'agit essentiellement d'un package R spécifiquement conçu pour ce type de tâche (ArrayQualityMetrics), auquel d'autres modules ont été ensuite ajoutés.

En 2014 l'atelier a continué à traiter des projets d'analyse de miARN sur microarray Agilent ; il s'agit d'un flux de travail simple et robuste, qui permet d'obtenir rapidement des résultats à partir de quantités relativement faibles d'ARN total (100 ng).

De plus, des nouvelles méthodes sont en cours de développement ou en phase de mise en place. En particulier, la plateforme se concentre maintenant sur les protocoles brin spécifiques et sur les protocoles permettant de travailler sur des faibles quantités d'ARN (1.0 - 0.5 ng).

 

 

Rédacteur: Marco Moroldo - Dernière modification: 20 November 2014